• Document: ANEXOS. Anexo 1 Transformación mediante electroporación
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Desarrollo de marcadores SCAR y CAPS en un QTL con efecto importante sobre la resistencia al tizón tardío de la papa. Trujillo Luján, Guillermo. Derechos reservados conforme a Ley ANEXOS Anexo 1 Transformación mediante electroporación En este método de transformación de E. coli se requieren células electrocompetentes. La preparación de estas células consta de los siguientes pasos: 1. Preparación de bacterias electrocompetentes de E. coli a. Sembrar en 10 ml de medio LB líquido una colonia de E coli (cepa DH5á) y dejar crecer toda la noche a 37°C en agitación constante (225 rpm). b. Inocular 1 litro de medio líquido LB con el volumen de 10 ml (1/100) del cultivo fresco de E. coli. c. Hacer crecer las células a 37°C en agitación constante (225 rpm) hasta que lleguen a una concentración entre 0.5 a 0.8 de densidad óptica (OD) 600 nm. d. A partir de este paso trabajar todo en frío (hielo). Para cosechar, enfriar el erlenmeyer, que contiene el medio LB inoculado, en hielo por 15-30 minutos y centrifugar en frío a 5000 rpm por 15 minutos. e. Resuspender en un litro de agua estéril fría. Centrifugar como en el paso d. f. Resuspender en 0.5 l de agua estéril fría. Centrifugar como en el paso d. g. Resuspender en 20 ml de glicerol estéril frío al 10%. Centrifugar como en el paso d. h. Resuspender en un volumen final de 2 ml de glicerol estéril frío al 10%. i. Tomar alícuotas de 50 ìl y congelarlas en nitrógeno líquido. j. Almacenar a –70°C. Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Desarrollo de marcadores SCAR y CAPS en un QTL con efecto importante sobre la resistencia al tizón tardío de la papa. Trujillo Luján, Guillermo. Derechos reservados conforme a Ley Medio LB (Luria-Bertani) líquido Para 1 litro: Disolver 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl en 950 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH y llevar el volumen a 1 litro. Autoclavar en ciclo líquido por 20 minutos a 15 lbs/plg2 . Dejar enfriar hasta ~55°C para agregar el antibiótico de selección, si fuera necesario. 2. Electroporación de E. coli a. Agregar 2 ìl de la reacción de ligación al vial que contiene las bacterias electrocompetentes, mezclar suavemente. b. Transferir cuidadosamente la mezcla a una cubeta de electroporación (previamente enfriada) evitando la formación de burbujas. Secar bien la base de la cubeta. c. Aplicar un pulso eléctrico de 2.5 kV por 25 ms. d. Añadir inmediatamente 1 ml de medio SOC. e. Transferir a un tubo de ensayo con tapa e incubar a 37°C en agitación constante (250 rpm). f. Sembrar 100 – 400 ìl del cultivo mediante el método de diseminación, empleando una espátula de Drigalsky sobre placas Petri con medio LB sólido que contengan el antibiótico de selección (100 ppm de Ampicilina o Kanamicina). Además, cada placa debe contener 4 ìl de IPTG (200 mg/ml) y 40 ìl de X-gal (20 mg/ml) para poder hacer la selección de los clones que contengan los plásmidos recombinantes mediante el “white-blue screening”. g. Incubar a 37°C por toda la noche. Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Desarrollo de marcadores SCAR y CAPS en un QTL con efecto importante sobre la resistencia al tizón tardío de la papa. Trujillo Luján, Guillermo. Derechos reservados conforme a Ley Medio SOC Para 1 litro: Disolver 20 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 0.5 g de NaCl en 950 ml de agua destilada. Agregar 10 ml de KCl 250mM. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 5M, llevar el volumen a 980 ml. Autoclavar en ciclo líquido por 20 minutos a 15 lbs/plg2 . Dejar enfriar hasta ~55°C y agregar 10 ml de MgCl2 1M (autoclavado) y 10 ml de solución de glucosa 2M esterilizada por filtración. Medio LB (Luria-Bertani) sólido Para 1 litro (50 placas Petri): Disolver 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl en 950 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 5M y llevar el volumen a 1 litro. Agregar 15 g/L de agar. Autoclavar en ciclo líquido por 20 minutos a 15 lbs/plg2 . Dejar enfriar hasta ~55°C para agregar el antibiótico de selección. Sellar las placas. Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Desarrollo de marcadores SCAR y CAPS en un QTL con efecto importante sobre la resistencia a

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