• Document: Estudios bioquímicos y moleculares sobre la leucina aminopeptidasa de Fasciola hepatica
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UNIVERSIDAD DE LA REPUBLICA FACULTAD DE CIENCIAS LICENCIATURA EN BIOQUIMICA TESINA DE GRADO Estudios bioquímicos y moleculares sobre la leucina aminopeptidasa de Fasciola hepatica Sheila Giacaman Salvo Orientador: Dr. Carlos Carmona Unidad de Biología Parasitaria, Instituto de Biología, Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Instituto de Higiene AGRADECIMIENTOS Finalmente esta etapa ha culminado. Sin la ayuda de todas y de cada una de las personas que he tenido la suerte de conocer a lo largo de mi vida no hubiera sido posible. Primero, agradecer de todo corazón a mi familia…a mi madre y a mi hermana que me acompañaron en esta aventura que significó mi carrera y que, de forma incondicional, me apoyaron y entendieron mis ausencias y mis malos momentos. A mi padre, que a pesar de la distancia siempre estuvo presente. A Galli, que ha confiado en mí y me ha dado ánimo para seguir; y a mi abuelita que a pesar que de ya no está junto a nosotros se que nos está cuidando. Gracias también a mis compañeros de la UBP: Tatiana, Gabriela, Flaco, Patricia, Mono, Rodolfo, Pepe, por brindarme su valiosísima ayuda y amistad desde el primer momento y siempre. A mis queridos compañeros del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Leche, que me acompañaron dando ánimo en los momentos de crisis y en los momentos de felicidad. A mis amigos de hoy y de siempre, con los que he compartido gran parte de mi vida, los que me acompañaron durante la carrera, los que me acompañan desde la distancia…les agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, cariño, amistad y la fortaleza necesaria para seguir adelante. Finalmente, agradezco a mi tutor, Dr. Carlos Carmona, por la paciencia y por haber hecho posible este trabajo. . RESUMEN Fasciola hepatica causa considerables pérdidas monetarias en la producción agropecuaria a nivel mundial, principalmente a través de la infección del ganado ovino y bovino; mientras que el parasitismo de humanos es una enfermedad emergente con focos de hiperendemia en varios continentes. A pesar de que el tratamiento antihelmíntico es efectivo, a corto plazo, la emergente resistencia a estas drogas ha llevado a la necesidad del desarrollo de una vacuna contra F. hepatica. Varias décadas de investigación se han invertido, sin embargo aún no existe una vacuna comercial en el mercado. Diferentes antígenos vaccinales han sido aislados del parásito y caracterizados. Las proteínas son probablemente la primera opción elegida por la mayoría de los investigadores cuando se está buscando candidatos vaccinales, debido a que son relativamente fáciles de identificar. Además, muchas de ellas juegan un rol clave en el metabolismo del parásito, en la interacción con el huésped y en la modulación de la respuesta inmune de éste. Mediante la utilización de herramientas de la biología molecular se pueden producir proteínas en grandes cantidades de forma económica. Nuestro laboratorio ha venido investigando a las proteasas como potenciales candidatos vacunales contra la fascioliasis. La leucin aminopeptidasa (LAP), exopeptidasa perteneciente a la familia M17 aislada de los extractos somáticos del parásito adulto ha sido el candidato que ha mostrado mayor potencial inmunoprotector. Esta proteína nativa (FhLAPn) se mostró capaz de generar buenos niveles de protección en ovejas. Posteriormente, se logró clonar, expresar funcionalmente, como proteína de fusión con tiorredoxina de E. coli que contiene una cola de histidinas, y purificar una leucin aminopeptidasa recombinante de adultos de F. hepatica (FhLAPr) que se demostró idéntica a la proteína nativa inicialmente estudiada. Ensayos de vacunación en conejos y ovejas confirmaron el gran potencial que tiene esta proteína recombinante como candidato vaccinal, ya que se obtuvieron los mayores niveles de protección contra F. hepatica reportados hasta el presente en ovinos empleando proteínas recombinantes. El inconveniente que surgió de estos ensayos fue que la proteína se expresaba a bajos niveles, lo que comprometió su potencial producción nivel industrial. El principal objetivo de este trabajo es investigar nuevas formas de expresar la FhLAPr como forma de optimizar los niveles de expresión de la proteína de forma que en un futuro pueda ser producido a nivel industrial a un costo rentable. Para ellos se probó la modificación del vector de expresión pThioHisC, por pET50b(+) que permite la autoinducción, pero el gran tamaño de la proteína de fusión que expresaba este vector provocó la precipitación de la proteína recombinante por mal plegamiento. Además, se analizó el efecto del tiempo de inducción con IPTG y extracción de la proteína recombinante del paquete celular. Al analizar estas dos variables en conjunto, se vio que el mejor tiempo de inducción son 4 hs, donde se obtiene mayores niveles de la proteína recombinante. P

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